Truflunarþættir í PCR viðbrögðum

Meðan á PCR viðbrögðum stendur, eru sumir truflandi þættir oft komið fram.
Vegna mjög mikillar næmni PCR er mengun talin vera einn mikilvægasti þátturinn sem hefur áhrif á PCR niðurstöður og getur skilað rangar jákvæðar niðurstöður.
Jafn mikilvægar eru hinar ýmsu heimildir sem leiða til rangra neikvæðra niðurstaðna. Ef einn eða fleiri nauðsynlegir hlutar PCR blöndunnar eða mögnun viðbrögðin sjálf eru hindruð eða truflað er hægt að hindra greiningargreininguna. Þetta getur leitt til minni skilvirkni og jafnvel rangra neikvæðra niðurstaðna.
Til viðbótar við hömlun getur tap á heilleika markmiðs kjarnsýru komið fram vegna flutninga og/eða geymsluaðstæðna fyrir undirbúning sýnisins. Sérstaklega getur hátt hitastig eða ófullnægjandi geymsla leitt til skemmda á frumum og kjarnsýrum. Festing frumna og vefja og innfelling paraffíns eru vel þekktar orsakir DNA sundrungu og viðvarandi vandamál (sjá mynd 1 og 2). Í þessum tilvikum mun jafnvel ákjósanleg einangrun og hreinsun ekki hjálpa.

Mynd 1 | Áhrif hreyfingarleysi á DNA heiðarleika
Rafskaut agarósa hlaup sýndi að gæði DNA einangruð frá parafínhluta krufningar voru mjög mismunandi. DNA með mismunandi meðaltal brotalengda var til staðar í útdrættunum eftir festingaraðferðinni. DNA var aðeins varðveitt þegar það var fest í innfæddum frosnum sýnum og í jafnalausn hlutlausu formalíni. Notkun sterklega súrs bouin fixative eða óstífluðu, maurasýru sem inniheldur formalín leiddi til verulegs taps á DNA. Það sem eftir er er mjög sundurliðað.
Vinstra megin er lengd brotanna tjáð í kílóbasa pörum (KBP)

Mynd 2 | Tap á heilleika kjarnsýrumarkmiðs
(a) A 3′-5 ′ bil á báðum þræðunum mun leiða til brots á DNA markinu. Nýmyndun DNA mun enn eiga sér stað á litla brotinu. Hins vegar, ef grunnar glitunarstaður vantar á DNA brotið, kemur aðeins línuleg mögnun fram. Í hagstæðustu tilvikinu geta brotin endurstillt hvort annað, en ávöxtunin verður lítil og undir uppgötvunarstigum.
(b) Tap á grunni, aðallega vegna depurination og thymidine dimer myndunar, leiðir til fækkunar á fjölda H-skuldabréfa og lækkun á TM. Meðan á langvarandi hlýnunarfasanum stendur munu grunnarnir bráðna frá Matrix DNA og munu ekki glíma jafnvel við minna strangar aðstæður.
(c) Aðliggjandi týmínbasar mynda tt dimer.
Annað algengt vandamál sem kemur oft fram við sameindagreiningar er minna en ákjósanleg losun markfrumna í samanburði við útdrátt fenól-klóróforms. Í sérstökum tilvikum getur þetta verið tengt fölskum neikvæðum. Hægt er að spara mikinn tíma með sjóðandi lýsingu eða ensím meltingu frumu rusls, en þessi aðferð hefur oft í för með sér litla PCR næmi vegna ófullnægjandi losunar kjarnsýru.

Hömlun á fjölliðuvirkni við mögnun

Almennt er hömlun notuð sem gámahugtak til að lýsa öllum þáttum sem leiða til niðurstaðna PCR undiroptimals. Í stranglega lífefnafræðilegum skilningi er hömlun takmörkuð við virkni ensímsins, þ.e., það dregur úr eða kemur í veg fyrir umbreytingu undirlags af framleiðslu með samspili við virka staðinn á DNA fjölliðu eða kofaktor þess (td Mg2+ fyrir Taq DNA fjölliða).
Íhlutir í sýninu eða ýmsum stuðpúðum og útdrætti sem innihalda hvarfefni geta beint hindrað ensímið eða gripið cofactors þess (td EDTA) og þannig óvirkt fjölliðu og aftur á móti sem leiðir til minnkaðra eða rangra neikvæðra PCR niðurstaðna.
Samt sem áður eru mörg milliverkanir milli hvarfþátta og kjarnasýrur sem innihalda markið einnig tilnefnd sem „PCR hemlar“. Þegar heiðarleiki frumunnar raskast af einangrun og kjarnsýran losnar geta samspil milli sýnisins og nærliggjandi lausnar og fastfasa komið fram. Sem dæmi má nefna að 'hræslufólk' geta bundið stakar eða tvístrengdar DNA með samskiptum sem ekki eru samgildir og truflað einangrun og hreinsun með því að fækka markmiðum sem að lokum ná PCR viðbragðsskipinu.
Almennt eru PCR hemlar til staðar í flestum líkamsvökvum og hvarfefnum sem notuð eru við klínískar greiningarpróf (þvagefni í þvagi, blóðrauða og heparíni í blóði), fæðubótarefni (lífrænum íhlutum, glúkógeni, fitu, Ca2+ jónum) og íhlutum í umhverfinu (fenól, þungmælir)

Algengari PCR hemla er að finna í bakteríum og heilkjörnungafrumum, DNA sem ekki eru markhópur, DNA-bindandi makrómúlur vefjamats og rannsóknarstofubúnaðar eins og hanska og plast. Hreinsun kjarnsýrna við eða eftir útdrátt er ákjósanleg aðferð til að fjarlægja PCR hemla.
Í dag getur ýmsir sjálfvirkir útdráttarbúnaðar komið í stað margra handvirkra samskiptareglna, en 100% bata og/eða hreinsun markmiða hefur aldrei náðst. Hugsanlegir hemlar geta enn verið til staðar í hreinsuðum kjarnsýrum eða hafa þegar tekið gildi. Mismunandi aðferðir eru til til að draga úr áhrifum hemla. Val á viðeigandi fjölliðu getur haft veruleg áhrif á virkni hemla. Aðrar sannaðar aðferðir til að draga úr PCR hömlun eru að auka styrk fjölliðu eða beita aukefnum eins og BSA.
Sýnt er fram á hömlun á PCR viðbrögðum með því að nota innra gæðaeftirlit (IPC).
Gæta verður þess að fjarlægja öll hvarfefni og aðrar lausnir í útdráttarbúnaðinum, svo sem etanóli, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, ísóprópanól og fenól, frá kjarnsýru einangruninni með ítarlegu þvottaskrefi. Það fer eftir einbeitingu þeirra, þeir geta virkjað eða hindrað PCR.