Truflunarþættir í PCR viðbrögðum

Við PCR viðbrögðin koma oft upp truflandi þættir.
Vegna mjög mikillar næmni PCR er mengun talin einn mikilvægasti þátturinn sem hefur áhrif á PCR niðurstöður og getur valdið fölskum jákvæðum niðurstöðum.
Jafnframt eru ýmsar orsakir sem leiða til falskra neikvæðra niðurstaðna mikilvægar. Ef einn eða fleiri nauðsynlegir hlutar PCR-blöndunnar eða mögnunarviðbrögðin sjálf eru hamluð eða trufluð, getur greiningarprófið orðið fyrir barðinu á því. Þetta getur leitt til minni skilvirkni og jafnvel falskra neikvæðra niðurstaðna.
Auk hömlunar getur tap á heilleika markkjarnsýrunnar átt sér stað vegna flutnings- og/eða geymsluskilyrða fyrir undirbúning sýnisins. Einkum getur hátt hitastig eða ófullnægjandi geymsla leitt til skemmda á frumum og kjarnsýrum. Festing frumna og vefja og paraffíninnfelling eru vel þekktar orsakir DNA-sundrunar og viðvarandi vandamál (sjá myndir 1 og 2). Í þessum tilfellum mun jafnvel besta einangrun og hreinsun ekki hjálpa.

Mynd 1 | Áhrif hreyfingarleysis á heilleika DNA
Rafdráttur með agarósagel sýndi að gæði DNA sem einangrað var úr paraffínsneiðum krufninga voru mjög mismunandi. DNA af mismunandi meðallengdum brota var til staðar í útdrættunum eftir því hvaða festingaraðferð var notuð. DNA varðveittist aðeins þegar það var fest í frosnum sýnum og í hlutlausu formalíni með stuðpúða. Notkun sterks súrs Bouin-festiefnis eða óstuðpúðaðs formalíns sem innihélt maurasýru olli verulegu DNA-tapi. Eftirstandandi brot er mjög brotið.
Vinstra megin er lengd brota gefin upp í kílóbasapörum (kbp)

Mynd 2 | Tap á heilleika kjarnsýrumarkmiða
(a) 3′-5′ bil á báðum þráðum mun leiða til rofs í mark-DNA. Myndun DNA mun samt eiga sér stað á litla brotinu. Hins vegar, ef praimer-glæðingarstaður vantar á DNA-brotinu, á sér aðeins stað línuleg mögnun. Í hagstæðustu tilfellunum geta brotin mettað hvert annað aftur, en afköstin verða lítil og undir greiningarmörkum.
(b) Tap á basum, aðallega vegna afpúrunar og myndunar týmidíntvíliða, leiðir til fækkunar H-tengja og lækkunar á Tm. Á meðan á lengingu hlýnunarfasanum stendur bráðna praimerarnir frá DNA-fylkisins og munu ekki glæðast jafnvel við vægari skilyrði.
(c) Aðliggjandi týmínbasar mynda TT tvíliðu.
Annað algengt vandamál sem oft kemur upp í sameindagreiningum er ófullnægjandi losun markkjarnsýra samanborið við fenól-klóróform útdrátt. Í öfgafullum tilfellum getur þetta tengst fölskum neikvæðum niðurstöðum. Hægt er að spara mikinn tíma með suðulýsu eða ensímmeltingu frumuleifa, en þessi aðferð leiðir oft til lágrar PCR næmi vegna ófullnægjandi losunar kjarnsýra.

Hömlun á pólýmerasa virkni við mögnun

Almennt er hömlun notuð sem hugtak sem lýsir öllum þáttum sem leiða til ófullnægjandi PCR-niðurstaðna. Í stranglega lífefnafræðilegum skilningi er hömlun takmörkuð við virkni ensímsins, þ.e. hún dregur úr eða kemur í veg fyrir umbreytingu hvarfefnis í afurð með milliverkunum við virka stað DNA-pólýmerasa eða meðvirkni þess (t.d. Mg2+ fyrir Taq DNA-pólýmerasa).
Efni í sýninu eða ýmsar stuðpúðar og útdrættir sem innihalda hvarfefni geta hamlað ensíminu beint eða fangað meðvirkandi þætti þess (t.d. EDTA), og þannig gert pólýmerasann óvirkan og í kjölfarið leitt til minnkaðra eða falskt neikvæðra PCR niðurstaðna.
Hins vegar eru margar víxlverkanir milli hvarfefna og kjarnsýra sem innihalda skotmarkið einnig kallaðar „PCR-hemlar“. Þegar heilleiki frumunnar raskast við einangrun og kjarnsýran losnar, geta víxlverkanir átt sér stað milli sýnisins og umlykjandi lausnar þess og fasta fasa. Til dæmis geta „hýðisefni“ bundist ein- eða tvíþátta DNA í gegnum ósamgildar víxlverkanir og truflað einangrun og hreinsun með því að fækka skotmörkum sem að lokum ná PCR-viðbragðsílátinu.
Almennt eru PCR-hemlar til staðar í flestum líkamsvökvum og hvarfefnum sem notuð eru í klínískum greiningarprófum (þvagefni í þvagi, blóðrauði og heparíni í blóði), fæðubótarefnum (lífrænum efnum, glýkógeni, fitu, Ca2+ jónum) og efnum í umhverfinu (fenólum, þungmálmum).

Algengari PCR-hemlar má finna í bakteríum og heilkjörnungafrumum, DNA sem ekki er skotmark, DNA-bindandi stórsameindir í vefjafylkjum og rannsóknarstofubúnaði eins og hönskum og plasti. Hreinsun kjarnsýra meðan á útdrátt stendur eða eftir hann er æskileg aðferð til að fjarlægja PCR-hemla.
Í dag geta ýmsar sjálfvirkar útdráttaraðferðir komið í stað margra handvirkra aðferða, en 100% endurheimt og/eða hreinsun skotmarka hefur aldrei náðst. Hugsanlegir hemlar geta enn verið til staðar í hreinsuðum kjarnsýrum eða hafa þegar tekið gildi. Mismunandi aðferðir eru til til að draga úr áhrifum hemla. Val á viðeigandi pólýmerasa getur haft veruleg áhrif á hemlavirkni. Aðrar viðurkenndar aðferðir til að draga úr PCR hömlun eru að auka pólýmerasaþéttni eða nota aukefni eins og BSA.
Hægt er að sýna fram á hömlun á PCR viðbrögðum með því að nota innri gæðaeftirlit með ferlinu (IPC).
Gæta skal þess að fjarlægja öll hvarfefni og aðrar lausnir í útdráttarbúnaðinum, svo sem etanól, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ísóprópanól og fenól, úr kjarnsýrueinangruninni með því að þvo þær vandlega. Þau geta virkjað eða hamlað PCR, allt eftir styrk þeirra.