Truflunarþættir í PCR viðbrögðum

Við PCR viðbrögð koma oft upp einhverjir truflandi þættir.
Vegna mjög mikils næmni PCR er mengun talin vera einn mikilvægasti þátturinn sem hefur áhrif á niðurstöður PCR og getur gefið rangar jákvæðar niðurstöður.
Jafn gagnrýnivert eru hinar ýmsu heimildir sem leiða til falsk-neikvæðar niðurstöður. Ef einn eða fleiri nauðsynlegir hlutar PCR blöndunnar eða mögnunarviðbrögðin sjálf eru hindrað eða truflað, getur greiningargreiningin verið hindrað. Þetta getur leitt til minni skilvirkni og jafnvel rangra neikvæðra niðurstaðna.
Auk hömlunar getur tap á heilleika markkjarnsýru átt sér stað vegna flutnings og/eða geymsluaðstæðna fyrir undirbúning sýnis. Einkum getur hátt hitastig eða ófullnægjandi geymsla leitt til skemmda á frumum og kjarnsýrum. Frumu- og vefjafesting og paraffíninnfelling eru vel þekktar orsakir DNA sundrungar og viðvarandi vandamála (sjá myndir 1 og 2). Í þessum tilvikum mun jafnvel besta einangrun og hreinsun ekki hjálpa.

Mynd 1 | Áhrif hreyfingarleysis á DNA heilleika
Agarósa hlaup rafskaut sýndi að gæði DNA sem var einangrað úr paraffínsneiðum krufningar voru mjög mismunandi. DNA af mismunandi meðallengd brota var til staðar í útdrættinum eftir festingaraðferðinni. DNA varðveittist aðeins þegar það var fest í innfæddum frosnum sýnum og í jafnalausu hlutlausu formalíni. Notkun mjög súrs Bouin festaefnis eða óbuffaðs formalíns sem inniheldur maurasýru leiddi til verulegs taps á DNA. Það sem eftir er er mjög sundurleitt.
Til vinstri er lengd brota gefin upp í kílóbasapörum (kbp)

Mynd 2 | Tap á heilleika kjarnsýrumarkmiða
(a) 3′-5′ bil á báðum þráðum mun leiða til brots á mark-DNA. myndun DNA mun samt eiga sér stað á litla brotinu. Hins vegar, ef grunnhitunarstað vantar á DNA brotið, á sér aðeins stað línuleg mögnun. Í hagstæðasta tilvikinu geta brotin endurmettað hvert annað, en uppskeran verður lítil og undir greiningarmörkum.
(b) Tap á basum, aðallega vegna hreinsunar og týmidíndímermyndunar, leiðir til fækkunar á fjölda H-tengja og lækkunar á Tm. Meðan á ílengdum hlýnunarfasa stendur munu frumurnar bráðna burt frá DNA fylkisins og munu ekki glæða jafnvel við minna strangar aðstæður.
(c) Aðliggjandi týmínbasar mynda TT dimer.
Annað algengt vandamál sem kemur oft fyrir í sameindagreiningum er minna en ákjósanleg losun markkjarnasýra samanborið við fenól-klóróform útdrátt. Í sérstökum tilfellum getur þetta tengst fölskum neikvæðum. Það er hægt að spara mikinn tíma með sjóðandi leysingu eða ensímmeltingu á frumurusli, en þessi aðferð leiðir oft til lágs PCR næmis vegna ófullnægjandi kjarnsýrulosunar.

Hömlun pólýmerasavirkni meðan á mögnun stendur

Almennt séð er hömlun notuð sem ílátshugtak til að lýsa öllum þáttum sem leiða til óákjósanlegra PCR niðurstöður. Í algjörlega lífefnafræðilegum skilningi er hömlun takmörkuð við virkni ensímsins, þ.e. hún dregur úr eða kemur í veg fyrir umbreytingu hvarfefnis-afurða með víxlverkun við virka stað DNA pólýmerasans eða cofactor hans (td Mg2+ fyrir Taq DNA pólýmerasa).
Hlutar í sýninu eða ýmsir jafnalausnir og útdrættir sem innihalda hvarfefni geta hindrað ensímið beint eða innilokað samþætti þess (td EDTA), þar með óvirkjað pólýmerasann og aftur leitt til minnkaðra eða rangra neikvæðra PCR niðurstöður.
Hins vegar eru margar víxlverkanir milli hvarfþátta og kjarnsýra sem innihalda markmið einnig tilgreindar sem „PCR-hemlar“. Þegar heilleika frumunnar hefur verið rofið með einangrun og kjarnsýran er losuð geta víxlverkanir átt sér stað milli sýnisins og nærliggjandi lausnar þess og fasta fasa. Til dæmis geta „hreinsunarefni“ bundið ein- eða tvíþátta DNA með ósamgildum milliverkunum og truflað einangrun og hreinsun með því að fækka skotmörkum sem að lokum ná til PCR hvarfílátsins.
Almennt eru PCR hemlar til staðar í flestum líkamsvökvum og hvarfefnum sem notuð eru við klínískar greiningarprófanir (þvagefni í þvagi, blóðrauði og heparín í blóði), fæðubótarefni (lífrænir þættir, glýkógen, fita, Ca2+ jónir) og efni í umhverfinu (fenól , þungmálmar)

Algengari PCR hemlar má finna í bakteríum og heilkjörnungafrumum, DNA sem ekki er markhópur, DNA-bindandi stórsameindum vefja fylkja og rannsóknarstofubúnaði eins og hanska og plasti. Hreinsun á kjarnsýrum á meðan eða eftir útdrátt er ákjósanlegasta aðferðin til að fjarlægja PCR hemla.
Í dag getur ýmis sjálfvirk útdráttarbúnaður komið í stað margra handvirkra samskiptareglna, en 100% endurheimt og/eða hreinsun markmiða hefur aldrei náðst. Hugsanlegir hemlar geta enn verið til staðar í hreinsuðu kjarnsýrunum eða hafa þegar tekið gildi. Mismunandi aðferðir eru til til að draga úr áhrifum hemla. Val á viðeigandi pólýmerasa getur haft veruleg áhrif á hemlavirkni. Aðrar sannaðar aðferðir til að draga úr PCR hömlun eru að auka styrk pólýmerasa eða nota aukefni eins og BSA.
Hægt er að sýna fram á hömlun á PCR viðbrögðum með því að nota innra gæðaeftirlit (IPC).
Gæta þarf þess að fjarlægja öll hvarfefni og aðrar lausnir í útdráttarsettinu, svo sem etanól, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ísóprópanól og fenól, úr kjarnsýrueinangrinu með vandlega þvottaskref. Það fer eftir styrk þeirra, þeir geta virkjað eða hamlað PCR.